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甲基化组比较分析鉴定人类大脑进化中的表观遗传调节位点
Comparative Methylome Analyses Identify Epigenetic Regulatory Loci of Human Brain Evolution
Molecular Biology Evolution (2018) 33(11):2947–2959
doi:10.1093/molbev/msw176
人类大脑非常特别，与其他动物相比，人类大脑所占身体比例要高很多，而且这是在短暂的时间内变化而成。已有分析证明进化在多个层次改变了人类大脑，而有趣的是，目前人类大脑相关研究发现表观遗传机制在大脑的调节功能，发育和神经反应等方法具有至关重要的作用。
目前研究开始阐明人类和非人类灵长类动物的大脑之间的表观遗传差异。已有研究通过对人类和黑猩猩大脑全基因组甲基化组图谱进行比较，但关注点仅为基因启动子区域，并未对可能的甲基化差异区域进行分析。同时也缺少外类群物种进行比较，限制了对人类甲基化特异性的推断。重要的是，大量脑样本的数据集对于确定高可信度的物种水平表观遗传分歧结果至关重要。
2. 主要分析流程：
（1）序列比对及差异甲基化区域（DMR）鉴定
原始序列通过FastQC和TrimGalore进行质量控制并去除接头序列以及低质量序列。甲基化数据通过Bismark和BsMap比对到人类、黑猩猩和猕猴的参考基因组（版本分别是hg19、pantro4和rheMac3），并将有相同开头结尾的序列当作冗余去除。比对后的结果通过BSmooth进行DMR的鉴定，初步鉴定出的候选DMR首先必须含有在至少两个个体中有两条读序支持的CpG位点，同时每个候选DMR中必须包含超过10个CpG位点以及两个物种间的最小部分甲基化差异水平在0.3。两者比对工具鉴定出的DMR结合出最终结果。
（2）DMR 特异性鉴定 （人类或黑猩猩）
猕猴的甲基化数据被用于DMR的特异性鉴定。当人和猕猴之间的甲基化差异大于黑猩猩和猕猴之间的甲基化差异时，这类DMR被认定为人类特异的DMR。其中的具体鉴定标准为：人和猕猴的差异应大于0.15。
（3）DMR 功能注释
本文通过ChiPSeeker软件根据UCSC数据库中的KnowGene对DMR进行功能注释。GO注释通过GoStat R包和13455人类黑猩猩同源基因集进行注释。GWAS富集分析通过traseR 软件包完成，并结合dbGaP、NHGRI GWAS Catalog以及HapMap CEU population等数据集对GWAS位点综合进行注释。
（4）DMR 表观遗传学特性鉴定
本文通过对人类特有的H3K4me3标记位点、4D基因组数据库的染色质互作、ENCODE的ChiP-Seq实验数据以及Roadmap表观组学等数据集进行分析来获得DMR相关的表观遗传学特性。着重对ENCODE项目中的来自91个不同组织的人类细胞系的ChiP-Seq实验数据结合转录因子进行分析来观测。
（5）基因表达量分析
对人类特有DMR（包括人类和黑猩猩以及猕猴的分别比较）进行观测是否会有显著的表达量变化。为了检测基因组水平上的显著性，在观测DMR基因表达量的同时，从所有基因中挑选相同数量的基因进行观测表达量的增长或减少，这样的分析共进行1000次并挑选出其中P<0.0.5的结果。
为了进一步确定初步鉴定的DMR的可靠性，即是否会由于不同个体的DNA差异而造成影响，因此进行了全基因组深度测序以及增加了一些额外的样本对278个DMR中的38个进行了目标区域的甲基化水平测定。如图 1所示，所有验证的DMR都显示出在人类与黑猩猩之间的差异，同时在加入更多的人类样本以及其他灵长类样本的情况下，人类特异性的DMR鉴定结果也和之前保持一致，说明一些物种特异DMR和物种差异相关联。同时通过深度测序也排除了核酸多态性会对DMR甲基化模式的影响。
灵长类动物的前额皮质由不同的细胞组成类型，最显着的是神经胶质和神经元细胞，它们可能表现出某些位点的不同表观遗传模式。通过对神经元细胞和非神经元细胞在人类和黑猩猩中进行甲基化数据比较，发现并没有显著的差异变化。
图1 DMR鉴定结果。
为了进一步深入了解DMR的功能，对DMR以及附近区域进行GO富集分析和进行GWAS分析。发现DMR以及邻近区域内的基因显著富集在几种GO发育过程中，包括神经系统发育，前脑发育和胚胎形态发生。在GWAS结果中，146个DMR区域与GWAS信号重叠，其中，24个DMR与大脑相关性状相关的变异相关，包括神经系统疾病相关，如阿斯伯格和阿斯伯格帕金森病。而人类特有的DMR在免疫翻译，骨骼和牙齿发育，这些和人类近期进化十分关联的性状上显著富集。这说明这些和大脑发育以及相关性状的DMR和人类近期进行十分关联。
图2 DMR基因组注释。
图3 DMR与表观遗传变化之间的协同性。
在三维基因组中，尤其是在亚TAD水平上，远端序列之间的相互作用（例如增强子和启动子之间）通常是由染色质环完成。而染色质环通过增强启动子相互作用来促进转录调控。结合4D 基因组数据库，在32个特异DMR中发现了19个显著的互作，并且这些互作的主要都发生在同一DMR或者邻近的两个DMR中。在对所有DMR的互作分析中，发现了近一半的DMR（132）和DMR区域有相互作用，247个DMR和非DMR区域有互作。说明DMR优先在会发生染色质环的区域并且有可能参与转录调控。
通过六种染色质标记对98种不同组织的DMR的染色质状态进行了调查，发现人类特异的去甲基化DMR的染色质状态是显著活性调节的，主要是启动子和增强子（图4），而大部分过甲基化DMR的染色质状态通常却被归为沉默一类。有趣的是，低甲基化DMR的启动子和增强子的染色质状态在人脑等组织中活性是最高的。
图4 人类不同组织的去甲基化DMR的染色质状态。
图5 DMR中的TFBS位点分析。
通过对去甲基化DMR内部或者周围（± 3kb）的新近产生的TFBS的单核苷酸替换进行检测，共鉴定出了51个TFBS中的41个人类特有单核苷酸替换。其中一个转录因子绑定位点PSMB2基因中存在的人类特有单核苷酸替换影响了它的启动子（图5B），而这个TFBS所对应的转录因子为BHLHE4基因。而转录因子BHLHE4基因是一个著名的生物钟基因，它的表达和重度抑郁症失调相关联。对应的转录因子绑定位点PSMB2基因的表达水平相对于黑猩猩和猕猴在人脑中显著增加（图5C）。除此以外，仍有许多转录因子和低甲基化DMR区域表现出绑定的可能，例如语言相关基因组FOXP2基因等。有趣的是，在DMR中观察的产生TFBS的突变速率要远比DMR之外低得多，表明这种突变在功能受限，在调控较强的区域不常发生。
Comparative Methylome Analyses Identify Epigenetic Regulatory Loci of Human Brain Evolution
Molecular Biology Evolution (2018) 33(11):2947–2959
doi:10.1093/molbev/msw176
背景
表观遗传学在发育、基因印记和疾病研究中有着重要作用，但是表观遗传在世代更替中遗传以及所带来的遗传结果仍然悬而未决。更不确定的是表观遗传信号在进化中是如何分化及其具体功能变化。人类大脑非常特别，与其他动物相比，人类大脑所占身体比例要高很多，而且这是在短暂的时间内变化而成。已有分析证明进化在多个层次改变了人类大脑，而有趣的是，目前人类大脑相关研究发现表观遗传机制在大脑的调节功能，发育和神经反应等方法具有至关重要的作用。
目前研究开始阐明人类和非人类灵长类动物的大脑之间的表观遗传差异。已有研究通过对人类和黑猩猩大脑全基因组甲基化组图谱进行比较，但关注点仅为基因启动子区域，并未对可能的甲基化差异区域进行分析。同时也缺少外类群物种进行比较，限制了对人类甲基化特异性的推断。重要的是，大量脑样本的数据集对于确定高可信度的物种水平表观遗传分歧结果至关重要。
主要材料方法
1. 数据：- 本文测序的大脑全基因组转录组测序数据数据编号为GSE77124以及全基因组甲基化测序数据和验证数据编号GSE85868。文章中分析用到的人类和黑猩猩的前额皮质的WGBS数据的数据编号是GSE37202。
2. 主要分析流程：
（1）序列比对及差异甲基化区域（DMR）鉴定
原始序列通过FastQC和TrimGalore进行质量控制并去除接头序列以及低质量序列。甲基化数据通过Bismark和BsMap比对到人类、黑猩猩和猕猴的参考基因组（版本分别是hg19、pantro4和rheMac3），并将有相同开头结尾的序列当作冗余去除。比对后的结果通过BSmooth进行DMR的鉴定，初步鉴定出的候选DMR首先必须含有在至少两个个体中有两条读序支持的CpG位点，同时每个候选DMR中必须包含超过10个CpG位点以及两个物种间的最小部分甲基化差异水平在0.3。两者比对工具鉴定出的DMR结合出最终结果。
（2）DMR 特异性鉴定 （人类或黑猩猩）
猕猴的甲基化数据被用于DMR的特异性鉴定。当人和猕猴之间的甲基化差异大于黑猩猩和猕猴之间的甲基化差异时，这类DMR被认定为人类特异的DMR。其中的具体鉴定标准为：人和猕猴的差异应大于0.15。
（3）DMR 功能注释
本文通过ChiPSeeker软件根据UCSC数据库中的KnowGene对DMR进行功能注释。GO注释通过GoStat R包和13455人类黑猩猩同源基因集进行注释。GWAS富集分析通过traseR 软件包完成，并结合dbGaP、NHGRI GWAS Catalog以及HapMap CEU population等数据集对GWAS位点综合进行注释。
（4）DMR 表观遗传学特性鉴定
本文通过对人类特有的H3K4me3标记位点、4D基因组数据库的染色质互作、ENCODE的ChiP-Seq实验数据以及Roadmap表观组学等数据集进行分析来获得DMR相关的表观遗传学特性。着重对ENCODE项目中的来自91个不同组织的人类细胞系的ChiP-Seq实验数据结合转录因子进行分析来观测。
（5）基因表达量分析
对人类特有DMR（包括人类和黑猩猩以及猕猴的分别比较）进行观测是否会有显著的表达量变化。为了检测基因组水平上的显著性，在观测DMR基因表达量的同时，从所有基因中挑选相同数量的基因进行观测表达量的增长或减少，这样的分析共进行1000次并挑选出其中P<0.0.5的结果。
主要结果
- 人类大脑中全基因组DMR的鉴定
为了进一步确定初步鉴定的DMR的可靠性，即是否会由于不同个体的DNA差异而造成影响，因此进行了全基因组深度测序以及增加了一些额外的样本对278个DMR中的38个进行了目标区域的甲基化水平测定。如图 1所示，所有验证的DMR都显示出在人类与黑猩猩之间的差异，同时在加入更多的人类样本以及其他灵长类样本的情况下，人类特异性的DMR鉴定结果也和之前保持一致，说明一些物种特异DMR和物种差异相关联。同时通过深度测序也排除了核酸多态性会对DMR甲基化模式的影响。
灵长类动物的前额皮质由不同的细胞组成类型，最显着的是神经胶质和神经元细胞，它们可能表现出某些位点的不同表观遗传模式。通过对神经元细胞和非神经元细胞在人类和黑猩猩中进行甲基化数据比较，发现并没有显著的差异变化。
图1 DMR鉴定结果。
- DMR的基因组注释
为了进一步深入了解DMR的功能，对DMR以及附近区域进行GO富集分析和进行GWAS分析。发现DMR以及邻近区域内的基因显著富集在几种GO发育过程中，包括神经系统发育，前脑发育和胚胎形态发生。在GWAS结果中，146个DMR区域与GWAS信号重叠，其中，24个DMR与大脑相关性状相关的变异相关，包括神经系统疾病相关，如阿斯伯格和阿斯伯格帕金森病。而人类特有的DMR在免疫翻译，骨骼和牙齿发育，这些和人类近期进化十分关联的性状上显著富集。这说明这些和大脑发育以及相关性状的DMR和人类近期进行十分关联。
图2 DMR基因组注释。
- DMR和表观遗传学证据的一致性
图3 DMR与表观遗传变化之间的协同性。
在三维基因组中，尤其是在亚TAD水平上，远端序列之间的相互作用（例如增强子和启动子之间）通常是由染色质环完成。而染色质环通过增强启动子相互作用来促进转录调控。结合4D 基因组数据库，在32个特异DMR中发现了19个显著的互作，并且这些互作的主要都发生在同一DMR或者邻近的两个DMR中。在对所有DMR的互作分析中，发现了近一半的DMR（132）和DMR区域有相互作用，247个DMR和非DMR区域有互作。说明DMR优先在会发生染色质环的区域并且有可能参与转录调控。
通过六种染色质标记对98种不同组织的DMR的染色质状态进行了调查，发现人类特异的去甲基化DMR的染色质状态是显著活性调节的，主要是启动子和增强子（图4），而大部分过甲基化DMR的染色质状态通常却被归为沉默一类。有趣的是，低甲基化DMR的启动子和增强子的染色质状态在人脑等组织中活性是最高的。
图4 人类不同组织的去甲基化DMR的染色质状态。
- DMR和转录因子（TF）绑定信号以及绑定位点（TFBS）和基因表达相关联
图5 DMR中的TFBS位点分析。
通过对去甲基化DMR内部或者周围（± 3kb）的新近产生的TFBS的单核苷酸替换进行检测，共鉴定出了51个TFBS中的41个人类特有单核苷酸替换。其中一个转录因子绑定位点PSMB2基因中存在的人类特有单核苷酸替换影响了它的启动子（图5B），而这个TFBS所对应的转录因子为BHLHE4基因。而转录因子BHLHE4基因是一个著名的生物钟基因，它的表达和重度抑郁症失调相关联。对应的转录因子绑定位点PSMB2基因的表达水平相对于黑猩猩和猕猴在人脑中显著增加（图5C）。除此以外，仍有许多转录因子和低甲基化DMR区域表现出绑定的可能，例如语言相关基因组FOXP2基因等。有趣的是，在DMR中观察的产生TFBS的突变速率要远比DMR之外低得多，表明这种突变在功能受限，在调控较强的区域不常发生。
小结
- 通过比较人类和黑猩猩大脑全基因组甲基化数据并加入猕猴数据作为外类群，鉴定出了278个人类特有DMR，并对其中38个进行独立的区域深度测序和重亚硫酸盐测序，证明了结果的可靠性。
- 人类和黑猩猩之间鉴定出的DMR大约一半落在启动子区域，而人类特有的DMR在免疫翻译，骨骼和牙齿发育等和人类近期进化相关功能显著富集，说明人类大脑特有DMR和人类近期进化十分相关。
- DMR和表观遗传学数据，包括染色质标记、三维基因中互作等，存在相当的关联，比如DMR优先在会发生染色质环的区域，说明DMR有可能参与到转录调控。
- DMR尤其是人类特有DMR和邻近基因表达相关联，DMR通过转录因子绑定位点来调节启动子以增强表观特征，说明DMR在人脑中是具有调节作用的热点区域。
