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标准化分析 > RNA测序 > circRNA测序 > circRNA测序案例2
环状RNA（circRNA）表达图谱揭示circHIPK3通过吸附多个miRNA起到调节细胞生长增殖的作用
Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs
DOI: 10.1038/ncomms11215
背景
环状RNA（circRNA）是一种通过反向剪接形成的、通过共价键闭合单链环形RNA分子。circRNA曾被认为是剪接过程中的副产物，但是最近的研究发现circRNA在各种细胞系和不同物种中都大量存在。与线性RNA相比，circRNA在有机体内更加稳定。circRNA主要存在于细胞质中，也有一些在外泌体中。最近的研究发现反向互补序列和一些特殊的蛋白质能够促进外显子的环化，进而形成circRNA。文献报道，大量的circRNA在小鼠神经发育和人类上皮间质转化过程中上调，这些报道揭示了circRNA可能不是剪接的副产物，而是具有调控作用。此外，最近的研究还阐述了circRNA可以通过吸附miRNA从而起到调控基因表达的作用。其中一个例子便是ciRS-7（也称CDR1as），作为miRNA的抑制剂，这个circRNA上具有70多个miR-7的绑定位点。然而仅有几个circRNA上含有多个miRNA绑定位点，并且大多数circRNA的功能仍然未知。
在人类多个细胞系和脑组织中已被鉴定到circRNA。本研究利用RNA-Seq数据在人类6个正常组织和7个癌症组织中鉴定到约27000个circRNA（至少有两条不同的读序支持），并且发现circHIPK3对细胞的生长增殖起到调节作用。
主要材料方法
1. 材料与数据
6个正常组织：脑、结肠、心脏、肝脏、肺和胃（Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA）
7个癌症组织：膀胱移行细胞癌（BLCA）、乳腺癌（BC）、结肠直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、胃癌（GC）、肾清细胞癌（KCA）和前列腺腺癌（PRAD）。其中人类原发性肝细胞癌和临近的非癌组织来自中国江苏省启东肝癌研究所，其他的六种癌症组织来自上海复旦大学肿瘤中心。
使用Illumina HiSeq 平台得到6个正常组织和7个癌症组织的去rRNA的转录组测序（ribosomal RNA-depleted RNA-Seq）数据。这些转录组测序数据在NCBI上的编码是GSE77661。
2. 主要分析流程
（1）人类circRNA的鉴定和circRNA表达量的计算
使用Tophat2软件，将测序的FASTQ数据比对到人类基因组（GRCh37/hg19版本，来自UCSC基因组数据库）。鉴定circRNA所使用的软件为find_circ。circRNA的表达量计算使用的是SRPBM公式（SRPBM=支持circRNA的读序数量/比对上的读序数量/读序长度）。成环比（circular ratio，CR）的计算公式为CR=支持circRNA的读序数量/（支持circRNA的读序数量+支持线性转录本的读序数量）。SRPBM和CR这两个值被用来筛选高表达的circRNA，并且继续后续的分析研究。
（2）人类circRNA的注释
根据circRNA的位置信息确定其在基因组上的母基因，再按照母基因的注释来确定circRNA的注释。其中基因组上编码基因的注释信息来自RefSeq和UCSC数据库。
（3）AGO2蛋白绑定位点的预测
AGO2蛋白绑定位点的序列信息下载自doRiNA（http://dorina.mdc-berlin.de）。通过这些下载的信息与circHIPK3的基因组序列比对，确定circHIPK3上的AGO2蛋白绑定位点。
（4）涉及的实验验证方法（简要）
本次实验涉及的实验方法有qRT–PCR、RNA FISH、质粒载体构建、northern blotting、CRISPR/Cas9技术敲除目标DNA片段、转染（oligonucleotide transfection）、RNA免疫沉淀（RIP）、报告基因检测（Luciferase reporter assay）等。
主要结果
1. 人类正常组织和癌症组织中cicRNA的鉴定
在6个正常组织和7个癌症组织中一共鉴定到27,296个候选circRNA（至少有两条不同的读序支持，图1a），其中19,071个circRNA已被先前的研究报道，8,225个circRNA是新鉴定的。超过80%的circRNA包含有蛋白编码基因的外显子（图1b）。大多数鉴定的circRNA的长度小于1500nt，并且circRNA长度的中位数大约为500nt（图1c）。通过SRPBM（spliced reads per billion mapping）对circRNA的表达量的标准化，发现circRNA在正常组织中的表达呈现组织特异性（图1d，图中的值是将SRPBM值取log10对数）。而circRNA在癌症组织和正常组织中的表达也存在差异。通过对正常组织和癌症组织的circRNA表达量的Wilcoxon秩和检验（Wilcoxon rank-sum test）发现，circRNA的表达量在BRCA、CRC、GC、HCC和PRAD中显著下调，在BLCA和KCA中显著上调（图1e）。此外，还有一些circRNA只在癌症组织或者正常组织中表达（图1f）。
图1 人类正常组织和癌症组织中的circRNA表达情况
2. 人类细胞中circRNA的特征
一个蛋白编码基因可以产生一个或者多个circRNA（图2a）。其中一个例子便是PTK2基因能够产生47个不同的circRNA。通过对来自一个基因位点的circRNA的表达量分析，发现50%母基因能够产生一个表达量显著高于其他的circRNA（图2b），这也就是说一个基因位点往往能够产生一个主要表达的circRNA。
成环比（circular ratio，CR）是一个计算circRNA丰度的指标，它是反向剪接读序数量除以反向剪接读序数量和线性剪接读序数量和的比值（图2c）。通过对CR值和SRPBM值的筛选（5’端CR＞0.2，3’端CR＞0.2，并且SRPBM＞1），发现了990个高表达丰度的circRNA（图2d红色圆点），并且其中的大多数circRNA的表达量高于线性基因的表达量。此外，这些高表达的circRNA的反向剪接接口附近的内含子的长度也比一般的circRNA长（图2e）。
有趣的是，研究人员发现来自HIPK3基因的第二个外显子的circRNA（circHIPK3）具有很高的表达量和CR值（图2d蓝色圆点）。HIPK3基因除了产生circHIPK3，还能够产生其他四种circRNA，分别为circHIPK3.2、circHIPK3.3、circHIPK3.4、circHIPK3.5（图3a），但是有高达1880条读序支持circHIPK3的反向剪接接口。circHIPK3的存在能够通过Sanger测序被实验证实（图3a）。通过qRT-PCR分析发现，circHIPK3的表达量显著高于其母基因的表达量（图3b，除了在肝脏组织中），并且circHIPK3在脑组织中特别高表达。通过比较circHIPK3和HIPK3转录本的稳定性发现，circHIPK3的半衰期超过了24小时，而HIPK3转录本的半衰期小于4个小时（图3c）。利用RNase R核酸外切酶（降解线性RNA）处理实验发现circHIPK3确实是环形的（图3d）。此外，通过细胞核和细胞质RNA的qRT-PCR分析和荧光原位杂交（FISH）发现，circHIPK3是位于细胞质的环状RNA（图3e和f）。
图2 人类细胞中circRNA的特征
图3 人类细胞中circHIPK3的特征
3. circHIPK3的形成
分析发现HIPK3基因的第二个外显子（产生circHIPK3）附近的内含子上存在高度反向互补的Alu重复序列，包括circHIPK3上游内含子上的28个SINE重复序列和下游内含子上的51个SINE重复序列（图4a）。前期研究表明circRNA附近的反向互补序列能够促进circRNA的形成，因此研究人员克隆了包含HIPK3基因第二个外显子以及上游1039nt和下游988nt的序列（图4b）。将该表达载体转染后，northern blot和qRT-PCR分析都发现了circHIPK3产物（图4c和d）。然后只有一边或者两个都没有Alu重复序列的表达载体，都不能检测到circHIPK3产物（图4c和d）。这也表明，两段反向的重复序列对circRNA的形成必不可少。
此外，研究人员还用CRISPR/Cas9在细胞内删除重复序列以探究重复序列对circRNA形成的影响。gRNA按照图4a所示设计。结果显示，下游Alu片段的缺失抑制了circHIPK3的形成（图4e），而上游Alu片段的缺失却促进了circHIPK3的形成（图4f）。猜想上游内含子上的其他Alu片段与下游的Alu片段配成了反向互补碱基对。进一步删除上游内含子大部分片段，发现circHIPK3的表达显著下调（图4g），但是HIPK3转录本的表达并没有受很大影响。这些研究表明反向互补的重复序列是circHIPK3的形成所必需的。
图4 两端长内含子序列促使circHIPK3的形成
4. 沉默circHIPK3能够抑制人类细胞增殖
研究人员通过RNA干扰技术沉默circHIPK3和HIPK3基因的表达。他们设计了三种小干扰RNA（图5a）：si-circHIPK3靶向circHIPK3的反向剪接接口序列，si-HIPK3靶向仅在HIPK3上的序列，si-both靶向circHIPK3和HIPK3都存在的序列。结果显示，si-circHIPK3仅影响circHIPK3的表达而不影响HIPK3的表达，si-both影响circHIPK3和HIPK3的表达（图5b）。随后的细胞增殖实验表明，在不同细胞类型中的circHIPK3下调都显著地抑制了细胞的增殖（图5c-e）。此外，EdU实验也表明circHIPK3的下调抑制了人类细胞的增殖（图5f和g）。这些结果都表明circHIPK3可能参与了人类细胞的增殖调节。
图5 沉默circHIPK3抑制人类细胞的增殖
5. circHIPK3能够作为分子海绵吸附miRNA
在线的AGO2免疫沉淀反应预测（doRiNA）表明，circHIPK3上有多个AGO2蛋白的结合位点（图6a）。为了验证这个预测结果，研究人员在HEK-293 T细胞系中构建了能稳定表达的Flag-AGO2和Flag-GFPRNA免疫沉淀体系（RIP），并且发现Flag-AGO2细胞系中的内源性circHIPK3的表达丰度高（图6b）。此外，研究人员还构建了一个circHIPK3片段，并且将它插入到荧光素酶报告基因的下游（LUC+circHIPK3）。他们猜测，通过circHIPK3吸附miRNA，以及miRNA介导的去甲基化和随后的核酸外切酶降解，能够抑制荧光素酶的活性。而实验结果发现，LUC+circHIPK3质粒上3’端非翻译区上的circHIPK3序列，能够引起荧光素酶活性的下调（图6c）。并且，敲除内源性circHIPK3也能降低荧光素酶的活性。相反的是，过表达circHIPK3能够提高荧光素酶的活性（图6c）。这些结果都表明circHIPK3可能有AGO2和miRNA的结合位点。
为了证明circHIPK3确实吸附了miRNA，研究人员进行了miRNA文库的荧光素酶筛选。所有miRNA都被插入到荧光素酶报告基因上，并且被转染到HEK-293 T细胞中。在424个实验的miRNA中，有9个（miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654）能够至少降低荧光素酶30%的活性（图6d）。但是qRT–PCR分析发现这些miRNA并不能显著降低circHIPK3的表达水平，也就是说这些miRNA可能并不是结合到circHIPK3上并且降解circHIPK3。随后，TargetScan和PicTar软件的预测发现，这些miRNA上至少包含一个与circHIPK3的结合位点（图6e）。因此，研究人员将这些miRNA上可能与circHIPK3的结合位点突变掉，发现转染这些突变后的质粒并没有对荧光素酶的活性产生显著影响（图6f）。并且，转染突变掉与miRNA结合位点的circHIPK3表达载体，也没有对荧光素酶的活性产生影响。这些结果都表明，circHIPK3可能能够作为分子海绵吸附miRNA。
曾有研究表明，以上找到的9个可能被circHIPK3吸附的miRNA在不同的细胞中都起到生长抑制的作用。研究人员因此将单个miRNA分别转染到到HEK-293 T细胞中。细胞增殖实验发现，4个miRNA（miR-124、miR-193、miR-379和miR-654）能够显著抑制HEK-293 T细胞的增殖，其中miR-124表现更为明显（图7a）。通过捕获体系中的miR-124成分，发现circHIPK3的表达量能够提高5倍以上（图7b）。细胞定位实验发现circHIPK3与miR-124之间存在相互作用（图7c）。此外，在敲除circHIPK3之后，miR-124的两个靶基因IL6R和DLX2（这两个基因都与促进细胞增殖相关）的表达量都出现下调，并且circHIPK3的异位表达能够改善IL6R和DLX2表达量下调的局面（图7d）。circHIPK3的异位表达还能够减弱miR-124的增殖抑制作用（图7e）。研究人员还调查了不同组织中circHIPK3和miR-124的表达水平和相关性。结果表明，circHIPK3和miR-124在脑组织中都高表达，并且他们的表达量在人类的多种正常组织中呈正向相关（图7f）。以上这些结果都表明，circHIPK3能够直接绑定miR-124，并且抑制它的活性。
图6 人类细胞中circHIPK3可作为miRNA分子海绵吸附多个miRNA
图7 circHIPK3吸附miR-124并且抑制miR-124的活性
小结
1. 本文在人类正常组织和癌症组织中鉴定了大量的circRNA，并且这些circRNA表现出组织特异性和癌症特异性。大多数circRNA的表达量较低，但是有些circRNA在基因位点上的表达量很高。此外，有大量的circRNA在不同组织中表达，或者在正常与癌症组织中差异表达，这些circRNA可能行驶着重要功能。
2. 大多数circRNA来源于mRNA前体。其中circHIPK3是来自于HIPK3基因第二个外显子的circRNA。circHIPK3两端附近是含有大量Alu重复序列的内含子，这些反向互补的重复序列可能与外显子的环化（circHIPK3形成）相关。
3. circHIPK3可以在人类细胞中通过吸附miRNA起到调节细胞生长增殖的作用。
Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs
DOI: 10.1038/ncomms11215
背景
环状RNA（circRNA）是一种通过反向剪接形成的、通过共价键闭合单链环形RNA分子。circRNA曾被认为是剪接过程中的副产物，但是最近的研究发现circRNA在各种细胞系和不同物种中都大量存在。与线性RNA相比，circRNA在有机体内更加稳定。circRNA主要存在于细胞质中，也有一些在外泌体中。最近的研究发现反向互补序列和一些特殊的蛋白质能够促进外显子的环化，进而形成circRNA。文献报道，大量的circRNA在小鼠神经发育和人类上皮间质转化过程中上调，这些报道揭示了circRNA可能不是剪接的副产物，而是具有调控作用。此外，最近的研究还阐述了circRNA可以通过吸附miRNA从而起到调控基因表达的作用。其中一个例子便是ciRS-7（也称CDR1as），作为miRNA的抑制剂，这个circRNA上具有70多个miR-7的绑定位点。然而仅有几个circRNA上含有多个miRNA绑定位点，并且大多数circRNA的功能仍然未知。
在人类多个细胞系和脑组织中已被鉴定到circRNA。本研究利用RNA-Seq数据在人类6个正常组织和7个癌症组织中鉴定到约27000个circRNA（至少有两条不同的读序支持），并且发现circHIPK3对细胞的生长增殖起到调节作用。
主要材料方法
1. 材料与数据
6个正常组织：脑、结肠、心脏、肝脏、肺和胃（Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA）
7个癌症组织：膀胱移行细胞癌（BLCA）、乳腺癌（BC）、结肠直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、胃癌（GC）、肾清细胞癌（KCA）和前列腺腺癌（PRAD）。其中人类原发性肝细胞癌和临近的非癌组织来自中国江苏省启东肝癌研究所，其他的六种癌症组织来自上海复旦大学肿瘤中心。
使用Illumina HiSeq 平台得到6个正常组织和7个癌症组织的去rRNA的转录组测序（ribosomal RNA-depleted RNA-Seq）数据。这些转录组测序数据在NCBI上的编码是GSE77661。
2. 主要分析流程
（1）人类circRNA的鉴定和circRNA表达量的计算
使用Tophat2软件，将测序的FASTQ数据比对到人类基因组（GRCh37/hg19版本，来自UCSC基因组数据库）。鉴定circRNA所使用的软件为find_circ。circRNA的表达量计算使用的是SRPBM公式（SRPBM=支持circRNA的读序数量/比对上的读序数量/读序长度）。成环比（circular ratio，CR）的计算公式为CR=支持circRNA的读序数量/（支持circRNA的读序数量+支持线性转录本的读序数量）。SRPBM和CR这两个值被用来筛选高表达的circRNA，并且继续后续的分析研究。
（2）人类circRNA的注释
根据circRNA的位置信息确定其在基因组上的母基因，再按照母基因的注释来确定circRNA的注释。其中基因组上编码基因的注释信息来自RefSeq和UCSC数据库。
（3）AGO2蛋白绑定位点的预测
AGO2蛋白绑定位点的序列信息下载自doRiNA（http://dorina.mdc-berlin.de）。通过这些下载的信息与circHIPK3的基因组序列比对，确定circHIPK3上的AGO2蛋白绑定位点。
（4）涉及的实验验证方法（简要）
本次实验涉及的实验方法有qRT–PCR、RNA FISH、质粒载体构建、northern blotting、CRISPR/Cas9技术敲除目标DNA片段、转染（oligonucleotide transfection）、RNA免疫沉淀（RIP）、报告基因检测（Luciferase reporter assay）等。
主要结果
1. 人类正常组织和癌症组织中cicRNA的鉴定
在6个正常组织和7个癌症组织中一共鉴定到27,296个候选circRNA（至少有两条不同的读序支持，图1a），其中19,071个circRNA已被先前的研究报道，8,225个circRNA是新鉴定的。超过80%的circRNA包含有蛋白编码基因的外显子（图1b）。大多数鉴定的circRNA的长度小于1500nt，并且circRNA长度的中位数大约为500nt（图1c）。通过SRPBM（spliced reads per billion mapping）对circRNA的表达量的标准化，发现circRNA在正常组织中的表达呈现组织特异性（图1d，图中的值是将SRPBM值取log10对数）。而circRNA在癌症组织和正常组织中的表达也存在差异。通过对正常组织和癌症组织的circRNA表达量的Wilcoxon秩和检验（Wilcoxon rank-sum test）发现，circRNA的表达量在BRCA、CRC、GC、HCC和PRAD中显著下调，在BLCA和KCA中显著上调（图1e）。此外，还有一些circRNA只在癌症组织或者正常组织中表达（图1f）。
图1 人类正常组织和癌症组织中的circRNA表达情况
2. 人类细胞中circRNA的特征
一个蛋白编码基因可以产生一个或者多个circRNA（图2a）。其中一个例子便是PTK2基因能够产生47个不同的circRNA。通过对来自一个基因位点的circRNA的表达量分析，发现50%母基因能够产生一个表达量显著高于其他的circRNA（图2b），这也就是说一个基因位点往往能够产生一个主要表达的circRNA。
成环比（circular ratio，CR）是一个计算circRNA丰度的指标，它是反向剪接读序数量除以反向剪接读序数量和线性剪接读序数量和的比值（图2c）。通过对CR值和SRPBM值的筛选（5’端CR＞0.2，3’端CR＞0.2，并且SRPBM＞1），发现了990个高表达丰度的circRNA（图2d红色圆点），并且其中的大多数circRNA的表达量高于线性基因的表达量。此外，这些高表达的circRNA的反向剪接接口附近的内含子的长度也比一般的circRNA长（图2e）。
有趣的是，研究人员发现来自HIPK3基因的第二个外显子的circRNA（circHIPK3）具有很高的表达量和CR值（图2d蓝色圆点）。HIPK3基因除了产生circHIPK3，还能够产生其他四种circRNA，分别为circHIPK3.2、circHIPK3.3、circHIPK3.4、circHIPK3.5（图3a），但是有高达1880条读序支持circHIPK3的反向剪接接口。circHIPK3的存在能够通过Sanger测序被实验证实（图3a）。通过qRT-PCR分析发现，circHIPK3的表达量显著高于其母基因的表达量（图3b，除了在肝脏组织中），并且circHIPK3在脑组织中特别高表达。通过比较circHIPK3和HIPK3转录本的稳定性发现，circHIPK3的半衰期超过了24小时，而HIPK3转录本的半衰期小于4个小时（图3c）。利用RNase R核酸外切酶（降解线性RNA）处理实验发现circHIPK3确实是环形的（图3d）。此外，通过细胞核和细胞质RNA的qRT-PCR分析和荧光原位杂交（FISH）发现，circHIPK3是位于细胞质的环状RNA（图3e和f）。
图2 人类细胞中circRNA的特征
图3 人类细胞中circHIPK3的特征
3. circHIPK3的形成
分析发现HIPK3基因的第二个外显子（产生circHIPK3）附近的内含子上存在高度反向互补的Alu重复序列，包括circHIPK3上游内含子上的28个SINE重复序列和下游内含子上的51个SINE重复序列（图4a）。前期研究表明circRNA附近的反向互补序列能够促进circRNA的形成，因此研究人员克隆了包含HIPK3基因第二个外显子以及上游1039nt和下游988nt的序列（图4b）。将该表达载体转染后，northern blot和qRT-PCR分析都发现了circHIPK3产物（图4c和d）。然后只有一边或者两个都没有Alu重复序列的表达载体，都不能检测到circHIPK3产物（图4c和d）。这也表明，两段反向的重复序列对circRNA的形成必不可少。
此外，研究人员还用CRISPR/Cas9在细胞内删除重复序列以探究重复序列对circRNA形成的影响。gRNA按照图4a所示设计。结果显示，下游Alu片段的缺失抑制了circHIPK3的形成（图4e），而上游Alu片段的缺失却促进了circHIPK3的形成（图4f）。猜想上游内含子上的其他Alu片段与下游的Alu片段配成了反向互补碱基对。进一步删除上游内含子大部分片段，发现circHIPK3的表达显著下调（图4g），但是HIPK3转录本的表达并没有受很大影响。这些研究表明反向互补的重复序列是circHIPK3的形成所必需的。
图4 两端长内含子序列促使circHIPK3的形成
4. 沉默circHIPK3能够抑制人类细胞增殖
研究人员通过RNA干扰技术沉默circHIPK3和HIPK3基因的表达。他们设计了三种小干扰RNA（图5a）：si-circHIPK3靶向circHIPK3的反向剪接接口序列，si-HIPK3靶向仅在HIPK3上的序列，si-both靶向circHIPK3和HIPK3都存在的序列。结果显示，si-circHIPK3仅影响circHIPK3的表达而不影响HIPK3的表达，si-both影响circHIPK3和HIPK3的表达（图5b）。随后的细胞增殖实验表明，在不同细胞类型中的circHIPK3下调都显著地抑制了细胞的增殖（图5c-e）。此外，EdU实验也表明circHIPK3的下调抑制了人类细胞的增殖（图5f和g）。这些结果都表明circHIPK3可能参与了人类细胞的增殖调节。
图5 沉默circHIPK3抑制人类细胞的增殖
5. circHIPK3能够作为分子海绵吸附miRNA
在线的AGO2免疫沉淀反应预测（doRiNA）表明，circHIPK3上有多个AGO2蛋白的结合位点（图6a）。为了验证这个预测结果，研究人员在HEK-293 T细胞系中构建了能稳定表达的Flag-AGO2和Flag-GFPRNA免疫沉淀体系（RIP），并且发现Flag-AGO2细胞系中的内源性circHIPK3的表达丰度高（图6b）。此外，研究人员还构建了一个circHIPK3片段，并且将它插入到荧光素酶报告基因的下游（LUC+circHIPK3）。他们猜测，通过circHIPK3吸附miRNA，以及miRNA介导的去甲基化和随后的核酸外切酶降解，能够抑制荧光素酶的活性。而实验结果发现，LUC+circHIPK3质粒上3’端非翻译区上的circHIPK3序列，能够引起荧光素酶活性的下调（图6c）。并且，敲除内源性circHIPK3也能降低荧光素酶的活性。相反的是，过表达circHIPK3能够提高荧光素酶的活性（图6c）。这些结果都表明circHIPK3可能有AGO2和miRNA的结合位点。
为了证明circHIPK3确实吸附了miRNA，研究人员进行了miRNA文库的荧光素酶筛选。所有miRNA都被插入到荧光素酶报告基因上，并且被转染到HEK-293 T细胞中。在424个实验的miRNA中，有9个（miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654）能够至少降低荧光素酶30%的活性（图6d）。但是qRT–PCR分析发现这些miRNA并不能显著降低circHIPK3的表达水平，也就是说这些miRNA可能并不是结合到circHIPK3上并且降解circHIPK3。随后，TargetScan和PicTar软件的预测发现，这些miRNA上至少包含一个与circHIPK3的结合位点（图6e）。因此，研究人员将这些miRNA上可能与circHIPK3的结合位点突变掉，发现转染这些突变后的质粒并没有对荧光素酶的活性产生显著影响（图6f）。并且，转染突变掉与miRNA结合位点的circHIPK3表达载体，也没有对荧光素酶的活性产生影响。这些结果都表明，circHIPK3可能能够作为分子海绵吸附miRNA。
曾有研究表明，以上找到的9个可能被circHIPK3吸附的miRNA在不同的细胞中都起到生长抑制的作用。研究人员因此将单个miRNA分别转染到到HEK-293 T细胞中。细胞增殖实验发现，4个miRNA（miR-124、miR-193、miR-379和miR-654）能够显著抑制HEK-293 T细胞的增殖，其中miR-124表现更为明显（图7a）。通过捕获体系中的miR-124成分，发现circHIPK3的表达量能够提高5倍以上（图7b）。细胞定位实验发现circHIPK3与miR-124之间存在相互作用（图7c）。此外，在敲除circHIPK3之后，miR-124的两个靶基因IL6R和DLX2（这两个基因都与促进细胞增殖相关）的表达量都出现下调，并且circHIPK3的异位表达能够改善IL6R和DLX2表达量下调的局面（图7d）。circHIPK3的异位表达还能够减弱miR-124的增殖抑制作用（图7e）。研究人员还调查了不同组织中circHIPK3和miR-124的表达水平和相关性。结果表明，circHIPK3和miR-124在脑组织中都高表达，并且他们的表达量在人类的多种正常组织中呈正向相关（图7f）。以上这些结果都表明，circHIPK3能够直接绑定miR-124，并且抑制它的活性。
图6 人类细胞中circHIPK3可作为miRNA分子海绵吸附多个miRNA
图7 circHIPK3吸附miR-124并且抑制miR-124的活性
小结
1. 本文在人类正常组织和癌症组织中鉴定了大量的circRNA，并且这些circRNA表现出组织特异性和癌症特异性。大多数circRNA的表达量较低，但是有些circRNA在基因位点上的表达量很高。此外，有大量的circRNA在不同组织中表达，或者在正常与癌症组织中差异表达，这些circRNA可能行驶着重要功能。
2. 大多数circRNA来源于mRNA前体。其中circHIPK3是来自于HIPK3基因第二个外显子的circRNA。circHIPK3两端附近是含有大量Alu重复序列的内含子，这些反向互补的重复序列可能与外显子的环化（circHIPK3形成）相关。
3. circHIPK3可以在人类细胞中通过吸附miRNA起到调节细胞生长增殖的作用。
