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通过宏基因组测序揭示了蚊子微生物群与疟疾载体中的杀虫剂抗性之间的联系
Whole metagenome sequencing reveals links between mosquito microbiota and insecticide resistance in malaria vectors
Scientific Reports (2018 8:2084
DOI:10.1038/s41598-018-20367-4
背景
杀虫剂抗药性是对全球疟疾控制问题中面临的迅速出现的威胁，特别是在非洲撒哈拉以南地区,但在拉丁美洲，工作重点已经从控制疟疾转移到了消除疟疾。疟疾病媒的控制主要依赖于室内杀虫剂喷洒和长效杀虫网来减少病媒群体数量和保护人们免受潜在的传染性蚊虫叮咬。这两种方法都是使用化学杀虫剂从而使得靶向群体产生杀虫剂抗药性，目前疟疾媒介中杀虫剂抗性的演变机制正被广泛研究中，特别是鉴于批准用于公共卫生用途的杀虫剂种类十分有限的情况下。迄今为止，疟疾载体杀虫剂抗性有四个可能的关键机制：靶位点不敏感、代谢抗性、行为改变和角质层改变。
据报道，拉丁美洲主要的沿海疟疾病媒按蚊（Anopheles albimanus）表现出多种杀虫剂抗药性，包括有机磷酸酯（OP）抗性。到目前为止，已有两种机制记录了An. albimanus的OP抗性：涉及非特异性酯酶水平升高的代谢抗性机制以及涉及乙酰胆碱酯酶（AChE）不敏感的靶向位点抗性机制。但是在An. Albimanus中杀虫剂抗性的选择模式和潜在导致对OP和其他类杀虫剂产生抗药性的因素仍然很大程度上尚未发现。
微生物在各种环境中定殖，包括昆虫组织，同时进行各种代谢功能，包括杀虫剂的降解。已有研究发现微生物与农业害虫的杀虫剂抗性相关，但它们与蚊子杀虫剂抗性是否相关尚不清楚。目前已有一些研究对蚊子的中重要的微生物种属等进行了研究，以确定它们在蚊子行为，生物学和病原体传播中的作用，以及它们在杀虫剂抗性中的潜在作用。而大多数与疟疾病媒杀虫剂抗药性的研究主要集中在撒哈拉以南地区非洲和东南亚的蚊子中，对拉丁美洲疟疾载体的研究很少，尤其是An. albimanus。
主要材料方法
1. 数据： 用于宏基因组测序的选用的是在5倍致死剂量杀螟松30分钟观察的雌性An. Albimanus，存活下来的为抗型，否则为易感型。宏基因组测序的原始序列已经上传到NCBI，数据编号为SRP108310。
2. 分析流程：
a. 原始序列质量控制：质量控制、去除接头以及低质量序列通过FastQC v0.11.5和Trimmomatic v0.35完成。
b. 去除蚊子基因组序列：指控后的序列通过BWA v0.77比对到An. Albimanus参考基因组（AalbS2），去除其中比对上的序列，剩下的序列用于下游分析。
c. 物种分类和功能注释：基因中序列通过DIAMOND v0.8.6中的BLASTx比对到NCBI-NR数据库，比对结果相近的序列组合在一起然后通过MEGAN v6.5.6中的LCA算法比对到NCBI物种数据库（(prot-acc2taxid-August2016.bin）和KEGG数据库（gi2kegg-Feb2015X.bin）用于物种分类和功能注释。
d. 比较和统计分析：通过使用FEN_Res和FEN_Sus的 MEGAN 文件生成了单个MEGAN比较文件。每个样本的Simpson倒数指数通过MEGAN产生，以确定样本的物种多样性（确定的细菌分类群的数量）和均匀度（相对的每个样本中每个标识的分类群的丰度）。通过STAMP v2.1.3分析比较文件产生每个分类的物种数量 、丰度以及KEGG功能注释的统计分析结果。对于每个样品，分配给每个鉴定的分类/功能的读数的相对丰度是计算。样品间的相对丰度结果使用Two-sided Fisher进行精确检验并用Benjamini-Hochberg FDR校正。 样品的显着性标准设定为p <0.05，并且在两个样本中小于100的比对读序的分组为未分类。
主要结果
1. 基础统计结果：
不同杀螟松抗性的雌性An. Albimanus进行混池宏基因组测序（抗型共30个个体，感性共10个个体）。共产生抗型83，947，332和易感型60，444，900条原始读序，其中分别91%和84%的读序经过质量控制，在去除序列低质量部分后，读序长度在60~232bp之间。在去除比对到An. Albimanus基因组上的序列后，共有63%和68%的抗型和易感型的读序保留。此外还有0.9%和0.8%的抗型和易感型的读序比对到细菌异型生物质降解通路的蛋白序列上。
2. 杀螟松抗型和易感型之间的细菌组成差异，其中在抗型中一种降解有机磷酸酯（OP）的细菌Klebsiella pneumoniae显著富集：
基于比对到NCBI-NR库以及使用NCBI分类树分析的结果，在抗型和易感型中共鉴定出103种细菌和一种未培养的β-变形杆菌（CBNPD1），共包括四个门，6个纲，12个目，13个科和37个属（图1）。其中37个属中的32个在抗型和易感型中均可以发现，而两个属（Bacillus 和 Halomonas）是抗型独有的，三个属（Stenotrophomonas， Microbacterium 和Lelliottia）是易感型特有。自上而下，Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Enterobacteriales 和 Pseudomonadales分别是丰度最大的细菌门（99%）、纲（98%）、属（93%）。如图1所示，在属的层面，Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia, 和Salmonella占总读数的93％以上。其中丰度最大的细菌种Klebsiella pneumoniae在抗型和易感型中分别占有74%和49%。
图1 杀螟松抗型和易感型基于序列比对到NCBI-NR库的细菌分类组成结果
在抗型和易感型之间确定的细菌类群的相对丰度方面存在显着差异。在抗型中具有较低的Simpson倒数指数（衡量分类丰富度和均匀度），抗型为1.4与易感型2.5。在两个样品中鉴定的四种细菌门中，Firmicutes 和 Actinobacteria相对丰度抗型明显高于易感型（p <0.0001），但在抗型中具有相应较低的（p <0.0001）Proteobacteria相对丰度。32种细菌属中的18个相对丰度抗型明显高于易感型（p <0.0001）。 这些富集的细菌属包括三个优势属， Klebsiella，Escherichia和Salmonella，其中Klebsiella是抗型中最富集的（差异达到 25.2％，p <0.0001）（图2）。 在抗型中相对丰度显著减少的有14个属（表1），其中Enterobacter表现出最大的减少幅度（差异达 -21.5％，p <0.0001）（图2）。
图2 杀螟松抗型和易感型主要细菌属的相对丰度差异
3. 杀螟松抗型和易感型之间的细菌异生素降解酶丰度差异，其中在抗型中存在OP降解羧酸酯酶抗磷酸和磷酸单酯酶富集：
基于KEGG对于读序的注释，共鉴定出88种细菌异生物降解酶，其中包括所有六类主要的酶：氧化还原酶，转移酶，水解酶，异构酶，裂解酶和连接酶，其中每个样品中超过80%由氧化还原酶，转移酶和水解酶构成超过80％。
图3 杀螟松抗型和易感型中异生素降解相关细菌酶分类相对丰度比较
水解酶（差异度 2.55％），异构酶（差异度 1.15％）和裂解酶（差异度 0.39％）的相对丰度相对于易感型在抗型中更高。这和抗型中的氧化还原酶的（差异度 -3.12％），连接酶（差异度 -0.44％），转移酶（差异度 -0.34％）和异构酶（差异度-0.22％）等的相对丰度降低保持统一（图3）。其中水解酶，最富集的酶类是由由两个显着富集（p <0.0001）的羧酸酯酶组成; 在抗型中，由两个显著富集的水解酶（p <0.0001）和两类显著富集（p <0.0001）的磷酸单酯酶，其中羧酸酯酶总体上最富集（图4）。除连接酶外，剩余酶中的其他六种酶也在抗型中显着富集（p <0.0001）（图4）。
图4 杀螟松抗型和易感型中涉及到的异生素降解相关细菌酶比较
4． 杀螟松抗型的微生物异生素降解途径，由杀螟松降解和其他OP降解细菌物种组成，同样也由体外杀虫剂实验验证。
抗型中的与微生物异生素降解途径相关的读序比对结果显示属于11属的21种细菌物种。这其中，13种细菌属于主要的5个属，Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia 和Salmonella。Bacillus属的细菌仅在抗型中鉴定出。除了Pluribacter属，抗型中每个与异生物降解相关的细菌属包含已被证明可以降解OP化合物，包括杀螟松等以及其他类别的农药。 同时通过宏基因组测序鉴定的抗型中的两种OP降解细菌B. cereus 和A. baumanni通过体外杀虫剂实验得到验证。
小结
该研究对An. Albimanus杀螟硫磷抗型（FEN_Res）和易感型（FEN_Sus）之间的微生物组分利用宏基因组测序（WMS）进行比较。介绍了抗型和易感型的微生物群和之间的差异，以及有关联微生物群和异生物降解相关的微生物差异，其中在抗型的微生物群中和异生物降解相关微生物种类和相关通路显著富集，并且其中两类OP降解相关细菌通过体外实验得到验证。
Whole metagenome sequencing reveals links between mosquito microbiota and insecticide resistance in malaria vectors
Scientific Reports (2018 8:2084
DOI:10.1038/s41598-018-20367-4
背景
杀虫剂抗药性是对全球疟疾控制问题中面临的迅速出现的威胁，特别是在非洲撒哈拉以南地区,但在拉丁美洲，工作重点已经从控制疟疾转移到了消除疟疾。疟疾病媒的控制主要依赖于室内杀虫剂喷洒和长效杀虫网来减少病媒群体数量和保护人们免受潜在的传染性蚊虫叮咬。这两种方法都是使用化学杀虫剂从而使得靶向群体产生杀虫剂抗药性，目前疟疾媒介中杀虫剂抗性的演变机制正被广泛研究中，特别是鉴于批准用于公共卫生用途的杀虫剂种类十分有限的情况下。迄今为止，疟疾载体杀虫剂抗性有四个可能的关键机制：靶位点不敏感、代谢抗性、行为改变和角质层改变。
据报道，拉丁美洲主要的沿海疟疾病媒按蚊（Anopheles albimanus）表现出多种杀虫剂抗药性，包括有机磷酸酯（OP）抗性。到目前为止，已有两种机制记录了An. albimanus的OP抗性：涉及非特异性酯酶水平升高的代谢抗性机制以及涉及乙酰胆碱酯酶（AChE）不敏感的靶向位点抗性机制。但是在An. Albimanus中杀虫剂抗性的选择模式和潜在导致对OP和其他类杀虫剂产生抗药性的因素仍然很大程度上尚未发现。
微生物在各种环境中定殖，包括昆虫组织，同时进行各种代谢功能，包括杀虫剂的降解。已有研究发现微生物与农业害虫的杀虫剂抗性相关，但它们与蚊子杀虫剂抗性是否相关尚不清楚。目前已有一些研究对蚊子的中重要的微生物种属等进行了研究，以确定它们在蚊子行为，生物学和病原体传播中的作用，以及它们在杀虫剂抗性中的潜在作用。而大多数与疟疾病媒杀虫剂抗药性的研究主要集中在撒哈拉以南地区非洲和东南亚的蚊子中，对拉丁美洲疟疾载体的研究很少，尤其是An. albimanus。
主要材料方法
1. 数据： 用于宏基因组测序的选用的是在5倍致死剂量杀螟松30分钟观察的雌性An. Albimanus，存活下来的为抗型，否则为易感型。宏基因组测序的原始序列已经上传到NCBI，数据编号为SRP108310。
2. 分析流程：
a. 原始序列质量控制：质量控制、去除接头以及低质量序列通过FastQC v0.11.5和Trimmomatic v0.35完成。
b. 去除蚊子基因组序列：指控后的序列通过BWA v0.77比对到An. Albimanus参考基因组（AalbS2），去除其中比对上的序列，剩下的序列用于下游分析。
c. 物种分类和功能注释：基因中序列通过DIAMOND v0.8.6中的BLASTx比对到NCBI-NR数据库，比对结果相近的序列组合在一起然后通过MEGAN v6.5.6中的LCA算法比对到NCBI物种数据库（(prot-acc2taxid-August2016.bin）和KEGG数据库（gi2kegg-Feb2015X.bin）用于物种分类和功能注释。
d. 比较和统计分析：通过使用FEN_Res和FEN_Sus的 MEGAN 文件生成了单个MEGAN比较文件。每个样本的Simpson倒数指数通过MEGAN产生，以确定样本的物种多样性（确定的细菌分类群的数量）和均匀度（相对的每个样本中每个标识的分类群的丰度）。通过STAMP v2.1.3分析比较文件产生每个分类的物种数量 、丰度以及KEGG功能注释的统计分析结果。对于每个样品，分配给每个鉴定的分类/功能的读数的相对丰度是计算。样品间的相对丰度结果使用Two-sided Fisher进行精确检验并用Benjamini-Hochberg FDR校正。 样品的显着性标准设定为p <0.05，并且在两个样本中小于100的比对读序的分组为未分类。
主要结果
1. 基础统计结果：
不同杀螟松抗性的雌性An. Albimanus进行混池宏基因组测序（抗型共30个个体，感性共10个个体）。共产生抗型83，947，332和易感型60，444，900条原始读序，其中分别91%和84%的读序经过质量控制，在去除序列低质量部分后，读序长度在60~232bp之间。在去除比对到An. Albimanus基因组上的序列后，共有63%和68%的抗型和易感型的读序保留。此外还有0.9%和0.8%的抗型和易感型的读序比对到细菌异型生物质降解通路的蛋白序列上。
2. 杀螟松抗型和易感型之间的细菌组成差异，其中在抗型中一种降解有机磷酸酯（OP）的细菌Klebsiella pneumoniae显著富集：
基于比对到NCBI-NR库以及使用NCBI分类树分析的结果，在抗型和易感型中共鉴定出103种细菌和一种未培养的β-变形杆菌（CBNPD1），共包括四个门，6个纲，12个目，13个科和37个属（图1）。其中37个属中的32个在抗型和易感型中均可以发现，而两个属（Bacillus 和 Halomonas）是抗型独有的，三个属（Stenotrophomonas， Microbacterium 和Lelliottia）是易感型特有。自上而下，Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Enterobacteriales 和 Pseudomonadales分别是丰度最大的细菌门（99%）、纲（98%）、属（93%）。如图1所示，在属的层面，Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia, 和Salmonella占总读数的93％以上。其中丰度最大的细菌种Klebsiella pneumoniae在抗型和易感型中分别占有74%和49%。
图1 杀螟松抗型和易感型基于序列比对到NCBI-NR库的细菌分类组成结果
在抗型和易感型之间确定的细菌类群的相对丰度方面存在显着差异。在抗型中具有较低的Simpson倒数指数（衡量分类丰富度和均匀度），抗型为1.4与易感型2.5。在两个样品中鉴定的四种细菌门中，Firmicutes 和 Actinobacteria相对丰度抗型明显高于易感型（p <0.0001），但在抗型中具有相应较低的（p <0.0001）Proteobacteria相对丰度。32种细菌属中的18个相对丰度抗型明显高于易感型（p <0.0001）。 这些富集的细菌属包括三个优势属， Klebsiella，Escherichia和Salmonella，其中Klebsiella是抗型中最富集的（差异达到 25.2％，p <0.0001）（图2）。 在抗型中相对丰度显著减少的有14个属（表1），其中Enterobacter表现出最大的减少幅度（差异达 -21.5％，p <0.0001）（图2）。
图2 杀螟松抗型和易感型主要细菌属的相对丰度差异
3. 杀螟松抗型和易感型之间的细菌异生素降解酶丰度差异，其中在抗型中存在OP降解羧酸酯酶抗磷酸和磷酸单酯酶富集：
基于KEGG对于读序的注释，共鉴定出88种细菌异生物降解酶，其中包括所有六类主要的酶：氧化还原酶，转移酶，水解酶，异构酶，裂解酶和连接酶，其中每个样品中超过80%由氧化还原酶，转移酶和水解酶构成超过80％。
图3 杀螟松抗型和易感型中异生素降解相关细菌酶分类相对丰度比较
水解酶（差异度 2.55％），异构酶（差异度 1.15％）和裂解酶（差异度 0.39％）的相对丰度相对于易感型在抗型中更高。这和抗型中的氧化还原酶的（差异度 -3.12％），连接酶（差异度 -0.44％），转移酶（差异度 -0.34％）和异构酶（差异度-0.22％）等的相对丰度降低保持统一（图3）。其中水解酶，最富集的酶类是由由两个显着富集（p <0.0001）的羧酸酯酶组成; 在抗型中，由两个显著富集的水解酶（p <0.0001）和两类显著富集（p <0.0001）的磷酸单酯酶，其中羧酸酯酶总体上最富集（图4）。除连接酶外，剩余酶中的其他六种酶也在抗型中显着富集（p <0.0001）（图4）。
图4 杀螟松抗型和易感型中涉及到的异生素降解相关细菌酶比较
4． 杀螟松抗型的微生物异生素降解途径，由杀螟松降解和其他OP降解细菌物种组成，同样也由体外杀虫剂实验验证。
抗型中的与微生物异生素降解途径相关的读序比对结果显示属于11属的21种细菌物种。这其中，13种细菌属于主要的5个属，Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Escherichia 和Salmonella。Bacillus属的细菌仅在抗型中鉴定出。除了Pluribacter属，抗型中每个与异生物降解相关的细菌属包含已被证明可以降解OP化合物，包括杀螟松等以及其他类别的农药。 同时通过宏基因组测序鉴定的抗型中的两种OP降解细菌B. cereus 和A. baumanni通过体外杀虫剂实验得到验证。
小结
该研究对An. Albimanus杀螟硫磷抗型（FEN_Res）和易感型（FEN_Sus）之间的微生物组分利用宏基因组测序（WMS）进行比较。介绍了抗型和易感型的微生物群和之间的差异，以及有关联微生物群和异生物降解相关的微生物差异，其中在抗型的微生物群中和异生物降解相关微生物种类和相关通路显著富集，并且其中两类OP降解相关细菌通过体外实验得到验证。
